Wasserstoff schützt die Lunge vor Verletzungen durch Hypoxie / Sauerstoffanreicherung, indem er die Produktion von Hydroxylradikalen verringert und Entzündungsreaktionen hemmt

Abstrakt

Hier untersuchten wir, ob Wasserstoff die Lunge vor chronischen Verletzungen durch Hypoxie / Sauerstoffanreicherung (H / R) schützen kann Wir entwickelten ein Mausmodell, bei dem die H / R-Exposition eine klinisch typische Lungenverletzung auslöste, die eine erhöhte Verdickung der Alveolarwand, Infiltration durch Neutrophile, Konsolidierung, Alveolarblutung, erhöhte Entzündungsfaktoren und Rekrutierung von M1-Makrophagen beinhaltete. Alle diese Prozesse wurden in Gegenwart von H 2 abgeschwächt Wir fanden heraus, dass eine H / R-induzierte Verletzung in unserem Mausmodell mit der Produktion von Hydroxylradikalen sowie einem erhöhten Gehalt an koloniestimulierenden Faktoren und zirkulierenden Leukozyten verbunden war. 2abgeschwächte H / R-induzierte Produktion von Hydroxylradikalen, Hochregulierung koloniestimulierender Faktoren und Rekrutierung von Neutrophilen und M1-Makrophagen in Lungengewebe. 2 hatte jedoch keinen wesentlichen Einfluss auf den H / R-induzierten Anstieg des Umbaus von Erythropoetin oder Lungenarterien. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass H 2 die H / R-induzierte Lungenverletzung verbessert, indem es die Produktion von Hydroxylradikalen und Entzündungen in der Lunge hemmt. Es kann auch verhindern, dass koloniestimulierende Faktoren Vorläufer als Reaktion auf eine H / R-induzierte Verletzung mobilisieren.

Einführung

Hypoxie / Re-Oxygenation (H / R) tritt häufig bei akuter Verschlimmerung und Remission von Asthma, Bronchiektasie und frühzeitiger chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) auf. Sie kann zu einer pulmonalen Entzündungsreaktion 1 führen und bestehende Lungenerkrankungen verschlimmern. H / R erhöht die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) durch die mitochondriale elektronische Transportkette 1 , NADPH-Oxidase 2 und Xanthinoxidase 3 . Unter physiologischen Bedingungen werden ROS in geringen Mengen produziert, um als Signalbotenstoffe zur Aufrechterhaltung der Zellfunktionen zu fungieren 4Eine übermäßige Produktion von ROS, insbesondere von Hydroxylradikalen infolge von H / R, schädigt Nukleinsäuren, Lipide und Proteine oxidativ. ROS induziert auch polymorphkernige Leukozyten, die an der Lungenmikrozirkulation 5 anhaften, um Lungenepithelzellen 6 , glatte Gefäßmuskelzellen 7 , Gefäßendothelzellen 8 und Alveolarepithelzellen vom Typ II 9 zu schädigen ROS in der Lunge können Entzündungsreaktionen auslösen, indem sie redoxempfindliche Transkriptionsfaktoren wie Aktivatorprotein-1, Hypoxie-induzierbaren Faktor-1 und Kernfaktor-Kappa B 10 , 11 aktivieren , die die Expression des koloniestimulierenden Granulozyten-Makrophagen-Faktors hochregulieren ( GM-CSF) 12, Granulozytenkolonie-stimulierender Faktor (G-CSF) 13 und Erythropoetin (EPO) 14 . Diese drei Faktoren können dazu beitragen, eine Lungenverletzung und einen Umbau der Lungengefäße einzuleiten, indem sie die Lungenentzündung 15 fördern und die Proliferation der glatten Lungengefäßmuskelzellen 16 erhöhen Außerdem wurde über Alveolarmakrophagen (AM) als kritischer Promotor für die Orchestrierung einer Lungen-H / R-Verletzung durch Hochregulierung der proinflammatorischen Faktoren 17 , 18 berichtet . Auf diese Weise wird die H / R-induzierte Lungenentzündung durch die Rekrutierung von Makrophagen und Neutrophilen sowie durch die Hochregulierung proinflammatorischer Faktoren wie Tumornekrosefaktor (TNF) -α, Interleukin (IL) -β und IL-6 19 charakterisiert ,20 .

Wasserstoff (H 2 ) ist ein ungiftiges, farbloses, geruchloses und transparentes Gas, das leicht reduzierbar ist und daher direkt mit starken Oxidationsmitteln wie dem Hydroxylradikal 21 reagieren kann Es übt entzündungshemmende, antiapoptotische und metabolische Wirkungen aus und kann die Genexpressionsmuster 22 verändern . Es hat therapeutische Wirkungen in Tiermodellen der Parkinson-Krankheit 23 , des Typ-2-Diabetes 24 , des Myokardinfarkts 25 , der akuten Hypoxie-induzierten Hirnverletzung 26 und der Lungeninfektion 27 gezeigt .

Diese Ergebnisse werfen die Frage auf, ob H 2 die H / R-induzierte Lungenverletzung abschwächen kann. Die vorliegende Studie untersuchte diese Frage anhand eines Mausmodells für chronische H / R-Lungenverletzungen.

Ergebnisse

Das Einatmen von 2 mildert die H / R-induzierte Lungenverletzung

Um die Auswirkungen von H 2 auf die H / R-induzierte Lungenverletzung zu untersuchen, wurden männliche C57BL / 6-Mäuse im Alter von 8 Wochen 4 Wochen (8 Stunden pro Tag) Hypoxie (10% O 2 , 90% N 2 ) und Hypoxie ausgesetzt kombiniert mit H 2 (10% O 2 , 4% H 2 , 86% N 2 ) oder Normoxie kombiniert mit H 2 (21% O 2 , 4% H 2 , 75% N 2 ) und dann in Normoxie für die weitere 16 h, um eine erneute Sauerstoffversorgung zu ermöglichen. Kontrollmäuse wurden kontinuierlich Normoxie ausgesetzt (21% O 2 , 79% N 2) für 4 Wochen. Nach 4 Wochen H / R trat eine signifikante Lungenverletzung auf, die durch Verdickung der Alveolarwand, Infiltration von Neutrophilen in das Lungeninterstitium und den Alveolarraum, Konsolidierung und Alveolarblutung gekennzeichnet war (Fig.  1A ). Bei H / R-exponierten Mäusen war der Lungenverletzungswert signifikant höher als bei mit Normoxie behandelten Mäusen (5,94 ± 1,96 gegenüber 0,85 ± 0,13, p <0,001;  1C ), und bei H / R-exponierten Tieren war ein geringerer Anstieg zu verzeichnen im Körpergewicht (5,65 ± 0,22 gegenüber 2,52 ± 0,30 g, p <0,001; Fig.  1B ). 2signifikant abgeschwächte H / R-induzierte Infiltration von Entzündungszellen und Verdickung der Alveolarwand, und es verringerte signifikant den Lungenverletzungswert (2,11 ± 0,38, p <0,001 gegenüber H / R). 2 führte auch zu einer größeren Zunahme des Körpergewichts bei hypoxischen Mäusen (3,86 ± 0,39 g, p = 0,019 gegenüber H / R), obwohl das Gewicht von hypoxischen Mäusen immer noch niedriger war als das von mit Normoxie behandelten Mäusen (p = 0,003) ).

Abbildung 1
Abbildung 1

Das Einatmen von Wasserstoff reduzierte die H / R-induzierte Lungenverletzung. Die Mäuse wurden 4 Wochen (8 Stunden pro Tag) Hypoxie, Hypoxie mit 4% H 2 oder Normoxie mit 4% H 2 ausgesetzt und dann in Normoxie (16 Stunden pro Tag) gehalten. Kontrollmäuse wurden in Normoxie gehalten (n = 10 in jeder Gruppe). A ) Hämatoxylin-Eosin-Färbung von Lungengeweben. B ) Gewichtsänderung zwischen vor und nach dem Experiment. C ) Lungenverletzungsergebnisse. Maßstabsbalken, 50 μm . Die gezeigten Daten sind Mittelwerte ± SEM. ns, nicht signifikant.

Um die Wirkung von H 2 auf den Umbau der Lungenarterie zu bewerten , haben wir den Prozentsatz der medialen Wandverdickung und des rechtsventrikulären Hypertrophie-Proliferationsindex (RHVI) gemessen. Der prozentuale Anteil der medialen Wandverdickung signifikant nach 4 Wochen der H / R erhöht (0.137 ± 0.004 vs 0,090 ± 0,003. Μ m, p <0,01, Fig  . 2A ), tat , wie RHVI (0,209 ± 0,009 vs 0,162 ± 0,010 g,. p <0,01; Fig.  2B ). 2 leicht reduziert H / R-induzierte medial Wandverdickung (0,123 ± 0,004 μ m, p = 0,03 vs . H / R), nicht aber H / R-induzierte RHVI (0,217 ± 0,023 g, p = 0,69 vs . H / R).

Figur 2
Figur 2

Begrenzte Wirkung von Wasserstoff auf die H / R-induzierte Umformung der Lungenarterie. Die Mäuse wurden wie in 1 beschrieben behandelt  (n = 10 in jeder Gruppe). A ) Repräsentative Schnitte, gefärbt mit Hämatoxylin-Eosin (oben) und Prozentsatz der Wandstärke von Lungenarteriolen in der Lunge (unten). B ) Mausherzen im Querschnitt (oben) und im rechtsventrikulären Hypertrophieindex (siehe Methoden) (unten). Die gezeigten Daten sind Mittelwerte ± SEM. ns, nicht signifikant.

Diese Ergebnisse legen nahe, dass H 2 die Lungenverletzung abschwächt, obwohl es den durch H / R induzierten Umbau der Lungenarterie nicht wesentlich beeinflusst.

Die Inhalation von 2 reduziert die H / R-induzierte Produktion von Hydroxylradikalen

Um zu verstehen, wie die Inhalation von 2 die Lunge vor H / R-induzierten Verletzungen schützen kann, wurde Gewebe von exponierten Tieren geschnitten und auf Hydroxylradikale gefärbt (Fig.  3A ), deren Spiegel dann durch Chromatometrie quantifiziert wurden (Fig.  3B ). H / R löste einen signifikanten Anstieg der Hydroxylradikale im Lungengewebe aus (0,72 ± 0,07 gegenüber 0,46 ± 0,02  μM / mg, p <0,001 gegenüber Normoxie), der in Gegenwart von H 2 (0,48 ± 0,02  μ ) deutlich niedriger war M / mg, p <0,001 gegen H / R, p = 0,79 gegen Normoxie).

Figur 3
Figur 3

Hemmung der H / R-induzierten Produktion von Hydroxylradikalen durch Wasserstoff. Die Mäuse wurden wie in 1 beschrieben behandelt  (n = 6 in jeder Gruppe). Lungenproben wurden geerntet, auf Hydroxylradikale gefärbt und quantifiziert. A ) Repräsentative Färbung von Lungengewebe auf Hydroxylradikale (ursprüngliche Vergrößerung, × 40). Die Schnitte wurden mit Hydroxyphenylfluoresceinlösung und DAPI gefärbt. Maßstabsbalken, 50  μm . B ) Quantifizierung von Hydroxylradikalen im Lungengewebe. Die gezeigten Daten sind Mittelwerte ± SEM. ns, nicht signifikant.

Die Inhalation von 2 schwächt sowohl die pulmonale als auch die systemische Entzündungsreaktion ab

Um die Wirkung von H 2 auf die durch chronisches H / R induzierte Lungenentzündung und systemische Entzündung zu überprüfen , wurden Entzündungsfaktoren in Lungengewebe und Serum untersucht. Lungengewebe von H / R-exponierten Mäusen zeigte signifikant höhere IL-1β- und TNF-α-Spiegel als Gewebe von Normoxie-exponierten Mäusen (IL-1β: 2137 ± 63 vs. 1734 ± 110 pg / mg; TNF-α: 1032 ± 48 vs. 675 ± 82 pg / mg, beide p <0,01 vs. H / R; Fig.  4A, B ). Ähnliche Ergebnisse wurden im Serum beobachtet (IL-1 & bgr;: 276 ± 31 gegenüber 180 ± 14 pg / ml; TNF-α: 126 ± 7 gegenüber 99 ± 5 pg / ml; beide p <0,01 gegenüber Hypoxie;  4C , D ). H / R in Gegenwart von H 2führten zu IL-1β-Spiegeln im Lungengewebe, die denen bei mit Normoxie behandelten Tieren ähnlich waren (1828 ± 124 pg / mg, p <0,05 gegenüber H / R, p = ns gegenüber Normoxie). Ähnliche Ergebnisse wurden für IL-1β-Spiegel im Serum (206 ± 16 pg / ml), TNF-α-Spiegel im Lungengewebe (740 ± 85 pg / ml) und TNF-α-Spiegel im Serum (106 ± 3 pg) beobachtet / ml) (alle p <0,05 vs. H / R, p = ns vs. Normoxie; Abb.  4A - D ).

Figur 4
Figur 4

Herunterregulierung der pulmonalen und systemischen Entzündungsreaktionen durch Wasserstoff. Die Tiere wurden wie in 1 beschrieben behandelt  (n = 10 in jeder Gruppe). Die rechte Lunge wurde am Ende der Experimente geerntet und homogenisiert. Nach der Zentrifugation wurden die Überstände geerntet und unter Verwendung kommerzieller ELISA-Kits auf IL-1 & bgr; ( A ) und TNF- & agr; ( B ) untersucht. Blutproben wurden ebenfalls extrahiert und zentrifugiert, um IL-1 & bgr; ( C ) und TNF- & agr; ( D ) im Serum zu testen Die gezeigten Daten sind Mittelwerte ± SEM. ns, nicht signifikant.

Da angenommen wird, dass die Hauptquelle für Entzündungsfaktoren in der Lunge pulmonale M1-Makrophagen sind, wurde Lungengewebe von H / R-exponierten Tieren auf M1-Makrophagen gefärbt. Diese Zellen waren im Lungengewebe von Tieren, die nur H / R ausgesetzt waren, reichlich vorhanden, aber sie waren selten im Gewebe von Tieren, die H / R in Gegenwart von H 2 ausgesetzt waren, und im Gewebe von mit Normoxie behandelten Tieren (Fig.  5A, B ). .

Abbildung 5
Abbildung 5

Färbung ( A ) und Quantifizierung ( B ) von M1-Makrophagen in der linken Lunge. Die Tiere wurden wie in 1 beschrieben behandelt  (n = 4 in jeder Gruppe). M1-Makrophagen wurden durch Immunfluoreszenz-Doppelfärbung mit Monozyten / Makrophagen-Marker (MOMA-2) und CD86 bestimmt. Die Schnitte wurden durch konfokale Mikroskopie untersucht. Die Anzahl der M1-Makrophagen im Lungengewebe wurde in einem 200 × -Feld für jedes Tier gezählt. Maßstabsbalken, 50 μm . Die gezeigten Daten sind Mittelwerte ± SEM. ns, nicht signifikant.

Unsere Beobachtung eines erhöhten Spiegels an Entzündungsfaktoren, Leukozyten, Neutrophilen und GM-CSF im Kreislauf infolge von H / R legt nahe, dass diese Exposition eine systematische Entzündungsreaktion hervorruft, die mit früheren Arbeiten 28 , 29 , 30 übereinstimmt Unsere Ergebnisse legen ferner nahe, dass H 2 diese Reaktion bei Mäusen abschwächt.

2 hemmt die Hochregulation von G-CSF und GM-CSF, ohne das EPO zu beeinflussen

H / R kann seine Wirkung durch Hochregulierung der durch CSFs 31 und EPO vermittelten Systeme ausüben Zählungen der folgenden Zellen waren signifikant höher in Geweben von H / R-exponierten Tieren als in Geweben von Normoxie-behandelten Kontrollen: Leukozyten [(3,79 ± 0,72) × 10 vs . (2,38 ± 0,34) × 10 9 / l, p = 0,026; Fig.  6A ], Neutrophile [(0,72 ± 0,13) × 10 vs . (0,23 ± 0,05) × 10 9 / l, p <0,001; Fig.  6B ] und Monozyten [(0,19 ± 0,05) × 10 vs (0,07 ± 0,02) × 10 9 / l, p = 0,015; Fig.  6C ]. H / R in Gegenwart von H 2führten zu ähnlichen Spiegeln dieser Zellen wie bei mit Normoxie behandelten Tieren: Leukozyten (1,82 ± 0,28) × 10 9 / l; Neutrophile (0,38 ± 0,11) × 10 9 / l; und Monozyten (0,09 ± 0,03) × 10 9 / L (alle p <0,05 gegenüber H / R, p> 0,05 gegenüber Normoxie; Fig.  6A - C ).

Abbildung 6
Abbildung 6

2 hemmt den H / R-induzierten Anstieg von G-CSF und GM-CSF, jedoch nicht die H / R-induzierte Hochregulation des EPO-Erythrozytensystems. Die Mäuse wurden wie in  1 behandelt (n = 10 in jeder Gruppe). Leukozyten ( A ), Neutrophile ( B ), Monozyten ( C ), Erythrozyten ( F ) und Hämoglobin ( G ) wurden unter Verwendung eines automatischen Blutanalysators untersucht. Die Serumspiegel von G-CSF ( C ), GM-CSF ( D ) und EPO ( H ) wurden unter Verwendung kommerzieller ELISA-Kits untersucht. Die gezeigten Daten sind Mittelwerte ± SEM. ns, nicht signifikant.

H / R führte auch zu signifikant höheren GM-CSF-Serumspiegeln als Normoxie (34,46 ± 0,15 gegenüber 26,50 ± 0,98 pg / ml) sowie zu signifikant höheren G-CSF-Spiegeln (125,08 ± 14,76 gegenüber 64,03 ± 7,72 pg) / ml, beide p <0,05; Abb.  6D - E ). H / R in Gegenwart von H 2 führte zu Konzentrationen von GM-CSF (27,26 ± 1,37 pg / ml) und G-CSF (78,57 ± 13,63 pg / ml) ähnlich denen bei mit Normoxie behandelten Tieren (alle p <0,05 vs. H / R, p> 0,05 gegen Normoxie).

H / R führte zu signifikant höheren EPO-Spiegeln als Normoxie (123,66 ± 1,90 gegenüber 114,00 ± 0,98 pg / ml) sowie zu einer signifikant höheren Anzahl von Erythrozyten [(10,87 ± 0,24) × 10 12 gegenüber (8,53 ± 0,24) × 10 12 / L] und Hämoglobinspiegel (172,86 ± 3,44 gegenüber 125,27 ± 3,12 g / l; alle p <0,05; Abb.  6F - H ). Die Spiegel nach Hypoxie in Gegenwart von H 2 waren ähnlich denen nach H / R ohne H 2 : EPO, 123,15 ± 2,56 pg / ml; Erythrozyten (11,12 ± 0,78) × 10 12 / l; Hämoglobin, 178,38 ± 11,63 g / l (alle p> 0,05 gegenüber H / R).

Diese Ergebnisse legen nahe, dass inhaliertes H 2 die H / R-Induktion des CSF-Systems, jedoch nicht des EPO-Systems hemmt.

2 schützt CD133 + -Vorläufer vor H / R-induzierten Verletzungen

Da G-CSF Vorläufer aus dem Knochenmark mobilisieren kann, in denen sich Verletzungsstellen befinden, um entzündungshemmende und reparierende Reaktionen hervorzurufen 32 , wollten wir testen, ob H / R Vorläufer mobilisiert, die Lungengewebe beherbergen. Daher untersuchten wir pulmonale und zirkulierende CD133 + -Vorläufer, bei denen es sich um pluripotentielle Zellen handelt, die durch G-CSF 33 mobilisiert werden können Diese Zellen waren in Lungengeweben nach H / R-Exposition reichlich vorhanden, während sie in Mäusen, die in Gegenwart von H 2 einer Hypoxie ausgesetzt waren, und in mit Normoxie behandelten Mäusen selten waren (  7A ). Die Durchflusszytometrie zeigte signifikant höhere Prozentsätze an pulmonalem CD133 +Vorläufer bei H / R-exponierten Mäusen (9,73 ± 1,95%) als bei mit Normoxie behandelten Mäusen (3,03 ± 1,06%, p = 0,007) und Mäusen, die H / R in Gegenwart von H 2 ausgesetzt waren (4,83 ± 1,87%, p = 0,024 gegen H / R, p> 0,05 gegen Normoxie; Fig.  7B ). Im Gegensatz dazu waren die Prozentsätze der zirkulierenden CD133 + -Zellen unter den verschiedenen Tiergruppen ähnlich (Fig.  7C ).

Abbildung 7
Abbildung 7

Wirkung von Wasserstoff auf CD133 + -Vorläufer. Die Mäuse wurden wie in 1 beschrieben behandelt  (n = 4 in jeder Gruppe). Lungenproben wurden für CD133 + -Zellfärbung ( A ) und Zählung ( B ) geerntet Blutproben wurden extrahiert und CD133 + -Zellen wurden gezählt ( C ). D ) Kultivierte CD133 + -Vorläufer wurden mit Hydroxyphenylfluoresceinlösung und DAPI gefärbt. Maßstabsbalken, 50 μm . Die gezeigten Daten sind Mittelwerte ± SEM. ns, nicht signifikant.

Als nächstes testeten wir die Auswirkungen von H / R und H 2 auf Vorläufer. Kulturen von Maus-CD133 + -Vorläufern wurden 8 h bei 37 ° C Hypoxie (10% O 2 , 5% CO 2 , 85% N 2 ) oder Hypoxie in Gegenwart von H 2 (10% O 2 , 5% CO) ausgesetzt 2 , 4% H 2 , 81% N 2 ). Kontrollkulturen wurden in Gegenwart von H 2 (5% CO 2 , 21% O 2 , 4% H 2 , 70% N 2 Normoxie (5% CO 2 , 95% Luft) oder Normoxie ausgesetzt). Die Gehalte an Hydroxylradikalen waren in Zellen, die Hypoxie ausgesetzt waren, höher als in mit Normoxie behandelten Zellen, und die meisten Radikale waren im Kern mit DAPI kolokalisiert (Fig.  7D ). 2 reduzierte die Gehalte an Hydroxylradikalen, insbesondere im Kern.

Unsere Ergebnisse legen nahe, dass H / R das Homing von CD133 + -Vorläufern zum Lungengewebe induziert , vermutlich um Schäden zu reparieren. 2 schützt CD133 + -Vorläufer vor H / R-Verletzungen durch Inaktivierung von Hydroxylradikalen.

Diskussion

In dieser Studie fanden wir, dass Mäuse, die chronischem H / R ausgesetzt waren, eine signifikante Lungenverletzung zeigten, die durch 4% H 2 -Inhalation signifikant verbessert wurde Die Behandlung mit 2 inhibierte die Bildung von Hydroxylradikalen und herunterregulierten GM-CSF und G-CSF, was die Infiltration durch Neutrophile und M1-Makrophagen sowie die Freisetzung entzündungsfördernder Faktoren abschwächen kann. 2 kann auch die Vorläuferzellen durch Inaktivierung von Hydroxylradikalen schützen (Abb.  8 ). Unsere Ergebnisse zeigen, dass molekularer Wasserstoff die Lunge wirksam vor H / R-induzierten Verletzungen schützt.

Abbildung 8
Abbildung 8

Mechanismen, durch die inhaliertes H 2 die H / R-induzierte Lungenverletzung lindern kann. H / R erhöht Hydroxylradikale, die verschiedene Zelltypen wie Epithelzellen, Fibroblasten, T-Zellen, B-Zellen, Neutrophile und Makrophagen aktivieren können. Das Nettoergebnis ist eine Hochregulierung koloniestimulierender Faktoren, die die Freisetzung von Leukozyten und Vorläufern aus dem Knochenmark stimulieren, die in entzündetes Lungengewebe wandern. Im Lungengewebe folgen infiltrierte Leukozyten und Monozyten der M1-Polarisation und setzen proinflammatorische Faktoren frei, die die Sekretion koloniestimulierender Faktoren erhöhen. Die Fähigkeit infiltrierter Vorläufer, Lungengewebe zu reparieren, ist beeinträchtigt. 2inaktiviert durch H / R induzierte Hydroxylradikale, die koloniestimulierende Faktoren herunterregulieren, wodurch die Freisetzung von Leukozyten aus dem Knochenmark und deren Infiltration in Lungengewebe gehemmt wird. Die Reparaturfähigkeit von Vorläufern kann sich ebenfalls verbessern.

Unsere Ergebnisse zeigten , dass H / R massive Erzeugung von Hydroxylradikalen, ähnlich zu früheren Berichten ausgelöst 34 , und das H 2 Einatmung verringerte diese Ebene, wahrscheinlich die Fähigkeit von etablierten H reflektierenden 2 zu desaktivieren Hydroxylradikale 22 , 35 . Die Abnahme der Hydroxylradikale war mit einer Verringerung von GM-CSF und G-CSF verbunden, gefolgt von einer Herunterregulierung der systemischen und pulmonalen Entzündungsreaktionen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die H / R-induzierte Produktion von Hydroxylradikalen wichtig für die Hochregulierung von CSFs ist, die durch H 2 -Inhalation beseitigt werden können .

CSFs sind wichtige Mediatoren sowohl für systemische als auch für Gewebeentzündungen, aber ihre Rolle bei H / R-induzierten Lungenverletzungen ist unklar. GM-CSF und G-CSF können aus verschiedenen Zelltypen, einschließlich Epithelzellen, Fibroblasten 36 , T-Zellen, B-Zellen 37 , Neutrophilen und Makrophagen 38, unter Stimulation von IL-1 & bgr; und TNF- & agr; 12 , 15 sekretiert werden Studien haben gezeigt , dass CSFs, insbesondere GM-CSF, Entzündung aggravate 39 durch proinflammatorische Cytokin - Produktion zu verbessern 40 und Leukozyten zu mobilisieren, um ihr Überleben zu fördern, Proliferation 41 , Differentiation 42 , und ihre Aktivierung stimulierenden 43 ,44 , 45 und Migration. Jüngste Studien zeigen, dass die GM-CSF-Blockade eine therapeutische Wirkung gegen Herzentzündungen während der Kawasaki-Krankheit oder der Bildung von Aortenaneurysmen 46 sowie gegen Lungenerkrankungen wie COPD 47 , interstitielle Lungenerkrankung 48 , Allergie 49 und Asthma 50 hat . Darüber hinaus fördert GM-CSF die Makrophagenpolarisation in Richtung M1-verzerrter Zellen 51 und stimuliert die Makrophagen-Plasminogenaktivatoraktivität 52, die eine Hochregulation entzündungsfördernder Faktoren induzieren können. Sowohl M1-Makrophagen als auch Neutrophile können Lungen- und systemische Entzündungen verschlimmern, indem sie proinflammatorische Faktoren und Elastase freisetzen. In der vorliegenden Studie fanden wir, dass H / R die Serumspiegel von GM-CSF und G-CSF erhöhte, gefolgt von einem Anstieg der Leukozyten und entzündungsfördernden Faktoren im Kreislauf und im Lungengewebe. Zusätzlich sammelten sich M1-Makrophagen im Lungengewebe an. Diese Ergebnisse legen nahe, dass CSFs Schlüsselmediatoren für H / R-induzierte Lungenverletzungen sind.

G-CSF fördert nicht nur Entzündungen, sondern mobilisiert auch Stammzellen aus dem Knochenmark zur Reparatur 53 . Um die Rolle dieser Zellen bei H / R-induzierten Lungenverletzungen zu bewerten, analysierten wir CD133 + -Zellen, eine homogene Population mit multiproliferativem Potenzial, von der zuvor gezeigt wurde, dass sie eine Rolle bei der Lungenreparatur spielt 54 , 55 . Wir fanden, dass H / R die Akkumulation von CD133 + -Vorläufern auslöste , obwohl dies nicht zu verhindern schien, dass Lungengewebe eine H / R-Verletzung erleidet. In unseren Experimenten mit CD133 + -Vorläuferkulturen erhöhte Hypoxie die Hydroxylradikale signifikant. Es ist möglich, dass diese Radikale bei den Vorläufern eine oxidative Schädigung verursachen und deren Fähigkeit zur Reparatur von Gewebe beeinträchtigen. Dies impliziert, dass H.2 verbessert die Vorläuferfunktion durch Inaktivierung von Hydroxylradikalen in diesen Zellen. Dies kann ein weiterer Grund für die Schutzwirkung von H 2 sein .

In unseren Experimenten erhöhte chronisches H / R den EPO-Spiegel im Serum, was die Anzahl der roten Blutkörperchen und die Blutviskosität erhöht und dadurch den Umbau der Lungenarterie als Reaktion auf chronisches H / R 56 unterstützt . Die Inhalation von 2 in unserem Mausmodell für H / R-induzierte Verletzungen hatte jedoch weder Einfluss auf das EPO-System roter Blutkörperchen noch auf den Umbau der Lungenarterie oder die rechtsventrikuläre Hypertrophie. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Hydroxylradikale das CSF-System aktivieren, nicht jedoch das EPO-System roter Blutkörperchen.

Zusammenfassend zeigt unsere Studie, dass H 2 die Lunge vor H / R-induzierten Verletzungen schützt, zumindest teilweise durch Abfangen von Hydroxylradikalen, wodurch die durch G-CSF und GM-CSF induzierte Lungenentzündung gehemmt wird. Dies hilft, CD133 + -Vorläufer vor oxidativen Schäden zu schützen Da die Inhalation von 1–4% H 2 keine Zytotoxizität zu zeigen scheint 35 , was mit dem übereinstimmt, was wir in dieser Studie gefunden haben, rechtfertigen unsere Ergebnisse weitere Arbeiten zur Entwicklung von H 2 zur Behandlung von H / R-induzierten Lungenverletzungen, beispielsweise während einer akuten Exazerbation und Remission von Asthma, Bronchiektasie und früher COPD.

Materialen und Methoden

Tier

Männliche C57BL / 6-Mäuse, die 8 Wochen alt waren, wurden vom Sichuan Provincial Experimental Animal Center zur Verfügung gestellt. Das H / R-Modell wurde wie folgt erstellt. Die Mäuse wurden in einen geschlossenen Behälter mit Einlass- und Auslassöffnungen auf beiden Seiten gegeben. Natriumkalk wurde am Boden des Behälters platziert, um CO 2 zu absorbieren Die Tiere wurden Hypoxie (10% O 2 , 90% N 2 ), Hypoxie in Gegenwart von H 2 (10% O 2 , 4% H 2 , 86% N 2 ) oder Normoxie (21% O 2 , 79 ) ausgesetzt % N 2 ) in Gegenwart von H 2 (21% O 2 , 4% H 2 , 75% N 2) (8 h pro Tag). Dann wurden sie 4 Wochen lang Luft zur erneuten Sauerstoffanreicherung (16 h pro Tag) ausgesetzt. Kontrollmäuse wurden 4 Wochen lang Normoxie (21% O 2 , 79% N 2 ) ausgesetzt Mäuse hatten während der gesamten Exposition freien Zugang zu Wasser und konventioneller Labordiät.

Wasserstoff (Reinheit> 99,9%) wurde unter Verwendung eines Wasserstoffgenerators (Beijing Zhongxing Huili Technology Development, Peking, China) erzeugt. Während der Experimente wurden die O 2 - und CO 2 -Konzentrationen unter Verwendung eines Philips Airway Gases-Monitors überwacht, und die H 2 -Konzentration wurde unter Verwendung eines STP1000-Multiplex-Gasanalysators (T & P Union (Peking), Peking, China) überwacht.

Alle Tierversuchsprotokolle wurden von der Ethikkommission für Tierversuche der Universität Sichuan genehmigt und gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt, der vom Institutional Animal Care and Use Committee der Universität Sichuan erstellt wurde.

Blutzellenzahl

Blutproben wurden aus der apikalen Arterie entnommen und die Blutzellen wurden unter Verwendung eines automatischen Blutanalysators (Sysmex-XE5000, Toagosei Co., Ltd., Yokohama, Japan) gezählt.

Histologische Verletzung der Lunge

Die Lunge wurde geerntet und über Nacht in 4% Paraformaldehyd bei 4 ° C fixiert. In Paraffin eingebettete Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt und unter einem Lichtmikroskop von einem Pathologen untersucht, der für die Versuchsgruppen blind war. Der Schweregrad der Lungenverletzung wurde anhand einer 5-Punkte-Skala 57 bewertet(0 = normale Histologie, 5 = schwerste Verletzung), die die Parameter Alveolarstauung, Blutung, Neutrophilenakkumulation im Luftraum oder in der Gefäßwand, Alveolarwanddicke und hyaline Membranbildung berücksichtigte. Wir haben 10 Bilder für jedes Tier zufällig ausgewählt und die Parameterwerte für die 10 Bilder gemittelt. Die Durchschnittswerte aller Parameter wurden dann addiert, um einen Gesamtwert für Lungenverletzungen zu erzeugen. Die Bewertung wurde von zwei Pathologen blind durchgeführt, und die beiden Bewertungen für ein bestimmtes Tier wurden gemittelt, um die endgültige Bewertung für dieses Tier zu erhalten.

Messung von Faktoren

Blutproben aus der apikalen Arterie wurden 10 min bei 4 ° C mit 3000 U / min zentrifugiert, um Serum zu erhalten. Um Lungengewebe zu erhalten, wurde die Lunge unmittelbar nach der Sterbehilfe auf Eis geerntet und gewogen. Ein Aliquot von Gewebe (50 mg) wurde zu 1-mm 3 Stücke zu 500  μ l PBS und homogenisiert. Die Proben wurden 5 min auf Eis gelassen und 20 min bei 4 ° C mit 3500 g zentrifugiert  Die Spiegel von EPO, G-CSF, GM-CSF, IL-1 & bgr; und TNF- & agr; im Serum- und Lungengewebeüberstand wurden unter Verwendung kommerzieller ELISA-Kits (Neobioscience Technology, Peking, China) untersucht.

Bewertung des Gefäßumbaus und der Hypertrophie des rechten Ventrikels

Der Umbau der Lungenarterie wurde als prozentuale mediale Dicke bewertet, die gemäß der folgenden Gleichung berechnet wurde: (mediale Wandstärke × 2) / Gefäßdurchmesser × 100% 58 . Nur Behälter mit einem kreisförmigen Aussehen und Außendurchmesser zwischen 50 und 100 μ m verwendet. Lungenschnitte wurden von einem Untersucher untersucht, der für eine experimentelle Behandlung unter Verwendung eines Olympus-BHS-Mikroskops blind war.

Die rechtsventrikuläre Hypertrophie wurde durch Berechnung des Verhältnisses von rechtem Ventrikel zu linkem Ventrikel plus Septumgewicht [RV / (LV + S)] quantifiziert. Die Ventrikel und das Septum wurden gesammelt und die feuchten und trockenen Ventrikel- und Septumgewichte wurden durch 24-stündiges Trocknen bei 60 ° C erhalten.

Hydroxylradikalfärbungen und -messungen

Gefrorene Schnitte (5 & mgr; m) der rechten Lunge wurden verwendet. Die Hydroxyphenylfluoresceinlösung (Sigma, USA) wurde 1: 500 verdünnt und 30 Minuten bei Raumtemperatur in den Lungengewebeschnitt gegeben. Die Schnitte wurden mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und dann mit 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI; Invitrogen, USA) gefärbt. Die Bilder wurden durch konfokale Mikroskopie analysiert.

Zur Quantifizierung von Hydroxylradikalen wurde Lungengewebe (100 mg) in flüssigem Stickstoff gemahlen, zu 500 ul PBS gegeben und 20 min bei 4 ° C mit 10 000 g zentrifugiert. Die Überstände wurden in Eppendorf-Röhrchen überführt und unter Verwendung eines kommerziellen kolorimetrischen Kits (Genmed, Scientifics, USA) so schnell wie möglich analysiert.

Immunfluoreszenz

Nach 4 Wochen H / R wurde die rechte Lunge geerntet und in gefrorene Schnitte (5 & mgr; m) geschnitten , die mit 4% Paraformaldehyd fixiert, mit PBS gewaschen und 1 h bei Raumtemperatur mit 1% Rinderserumalbumin blockiert wurden (Sigma, USA) in PBS.

Zum Nachweis von Vorläufern wurden an AF555 (Bioss, Peking, China) konjugierter Kaninchen-Anti-CD133-Antikörper und an AF488 (Bioss) konjugierter Kaninchen-Anti-Von-Willebrand-Faktor-Antikörper in einer Verdünnung von 1: 100 verwendet.

Zum Nachweis von M1-Makrophagen in der Lunge wurden Schnitte über Nacht bei 4 ° C mit Kaninchen-Anti-Maus-CD86-Antikörper (1: 100; Genetex, USA) und Ratten-Anti-Maus-MOMA-2-Antikörper (1:50; Genetex, USA) inkubiert. Dann wurden die Schnitte in PBS gewaschen und 1 h bei Raumtemperatur mit sekundären Antikörpern inkubiert, die an Alexa Fluor 488 oder 555 (1: 200; Biofroxx, Deutschland) konjugiert waren. Als negative Kontrolle wurden die Schnitte mit PBS anstelle des primären Antikörpers inkubiert. Die Schnitte wurden mit DAPI (Invitrogen) gefärbt, um die Kerne zu markieren. Die Bilder wurden dann unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops (LSM 510 Meta, Carl Zeiss) sichtbar gemacht, das mit einem 20 × / 0,75D-Objektiv ausgestattet war.

Durchflusszytometrische Analyse von CD133 + -Vorläufern

Das Blut wurde 1: 1 mit Hanks Lösung verdünnt, auf eine mononukleäre Zelltrennungslösung geschichtet und 35 min bei 4 ° C mit 1500 U / min zentrifugiert. Die weiße mononukleäre Zellschleife wurde erhalten, mit PBS gewaschen und 1 h bei 37 ° C mit an AF555 (Bioss) konjugiertem Anti-CD133-Antikörper inkubiert. Dann wurden zweimal gewaschenen Zellen, resuspendiert in 500  μ l PBS und mittels Durchflusszytometrie auf einem Esp Elite Gerät (Beckman Coulter, Chicago, IL, USA) analysiert. PBS diente als Negativkontrolle.

Zur Bestimmung von pulmonalen CD133 + -Zellen wurden geerntete Lungengewebe in 2 ml PBS und 1 mg / ml Liberase TM (Thermo Fisher Scientific, USA) gegeben. Die Gewebe wurden mit einer Schere zerkleinert und 30 Minuten bei 37 ° C verdaut, bevor sie durch ein 70 & mgr; m-Zellsieb und eine Lyse der roten Blutkörperchen filtriert wurden. Die Proben wurden dann durch ein 40 & mgr; m-Filter filtriert und resuspendiert, wonach CD133 + -Zellen wie oben beschrieben analysiert wurden.

Zellkultur

Knochenmark wurde wie beschrieben 59 durch Spülen der Femuren und Tibias von 2 Monate alten C57BL / 6-Mäusen mit vollständigem DMEM-LG-Medium (Thermo Fisher Scientific, USA) gesammelt Die Zellen wurden 24 h in einer Petrischale (Thermo Fisher Scientific) kultiviert, dann wurden nicht anhaftende Zellen durch Waschen mit PBS entfernt. Anhaftende Zellen wurden in vollständigem Medium weiter kultiviert und durch Trypsinisierung mit 0,25% Trypsin (Thermo Fisher Scientific) für 5 Minuten bei 37 ° C gewonnen. Behandelte adhärente Zellen wurden dreimal kultiviert und passagiert. CD133 + -Zellen der dritten Passage wurden unter Verwendung von immunomagnetischen Mikrokügelchen gewonnen und in vollständigem Medium weiter kultiviert. Kultivierte Zellen wurden gewonnen und ihre Morphologie und Fähigkeit zur Differenzierung in Osteoblasten und Adipozyten untersucht.

CD133 + -Zellen wurden in vier Petrischalen (2 × 10 5 Zellen / Schale) aufgeteilt und in Standardmedium kultiviert, das aus MEM alpha (20% fötales Rinderserum (FBS) + 1% Penicillin-Streptomycin (P / S) (Thermo Fisher) bestand Wissenschaftlich) zwei Tage lang und dann 8 Stunden lang bei 37 ° C in einer hypoxischen Atmosphäre (10% O 2 , 5% CO 2 , 85% N 2 ) oder einer hypoxischen Atmosphäre, die H 2 enthält (10% O 2 , 5 ), inkubiert % CO 2 , 4% H 2 , 81% N 2 ) Kontrollkulturen wurden in einer normoxischen Atmosphäre (5% CO 2 , 95% Luft) oder einer normoxischen Atmosphäre, die H 2 enthielt (5% CO 2 ), inkubiert21% O 2 , 4% H 2 , 70% N 2 ). Nach der 8-stündigen Inkubation wurden Hydroxyphenylfluoresceinlösung (1: 500) und Hoechst (1: 1000; Thermo Fisher Scientific) zu Kulturen gegeben, die für weitere 30 Minuten in ihre Inkubatoren zurückgebracht wurden. Dann wurden die Kulturen mit PBS gewaschen, unter normoxischen Bedingungen zentrifugiert und unter Verwendung von konfokaler Mikroskopie analysiert.

statistische Analyse

Die statistische Analyse wurde mit SPSS 18.0 (IBM, Chicago, USA) durchgeführt. Die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± SEM angegeben. Unterschiede zwischen mehr als zwei Gruppen wurden unter Verwendung einer Einweg-ANOVA bewertet. Die Signifikanzschwelle in allen statistischen Tests betrug p <0,05.

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Referenzen herunterladen

Danksagung

Wir danken Dr. Jiezhen Huang für ihre Unterstützung bei Tierversuchen. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81570374) unterstützt.

Informationen zum Autor

DT, MC und JZ haben zur Konzeption und Gestaltung dieser Studie beigetragen. LD, YQ und ZL haben zur Datenerfassung beigetragen. MC, SZ und YC führten Tierversuche durch. Alle Autoren haben zur Analyse und Interpretation der Daten beigetragen. MC, JZ und LD haben das Manuskript verfasst und kritisch auf wichtige intellektuelle Inhalte hin überarbeitet. MCYC und JZ halfen bei der Immunfluoreszenzfärbung, ELISAs und Zellkultur. Alle Autoren haben das Manuskript kommentiert und die endgültige Fassung genehmigt.

Korrespondenz mit Dongbo Tian .

Ethik-Erklärungen

Konkurrierende Interessen

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Zusätzliche Information

Anmerkung des Herausgebers: Springer Nature bleibt in Bezug auf Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Die Studien sind entnommen  aus :

www.molecularhydrogenfoundation.org, Molecular Hydrogen Foundation, USA, Tyler Le Baron

 

http://www.eimht.eu/ European Institut for Molecular Hydrogen Therapy

  

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ US National Library of MedicineNational Institutes of Health

 

http://www.molecularhydrogenstudies.com und öffentlichen wissenschaftlichen Medien, medical gas Research,Plus.org, science direkt u.a.  Wir danken der molecular Hydrogen foundation für die freundliche Genehmigung, Artikel und wissenschaftliche Grundlagen veröffentlichen zu dürfen, als auch anderen Instituten .