Therapeutisches Potenzial von molekularem Wasserstoff bei Eierstockkrebs Lei Shang 1,2 # , Fei Xie 1,2 # , Jiala Li 1,2 , Yating Zhang 1,2 , Mengyu Liu 1,2 , Pengxiang Zhao 1,2 , Xuemei Ma 1,2 , Tyler W. Lebaron 3 1 College of Life Science und Bioingenieurwesen, Beijing Molecular Hydrogen Research Center,Beijing University of Technology. Peking 100124. China; 2Forschungszentrum für molekularen Wasserstoff in Peking. Peking 100124. China; 3Molecular Hydrogen Institute, Kissimmee, FL. Vereinigte Staaten von Amerika Beiträge : (I) Konzeption und Design: X Ma, F Xie; (II) administrative Unterstützung: L Shang, J Li; (III) Bereitstellung von Studienmaterial oder Patienten: M Liu; (IV) Erhebung und Zusammenstellung von Daten: L Shang, J Li; (V) Datenanalyse und Interpretation: L Shang, F Xie, P Zhao; (VI) Manuskriptschreiben: Alle Autoren; (VII) Endgültige Genehmigung des Manuskripts: Alle Autoren. #Diese Autoren haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen. Korrespondenz mit: Xuemei Ma. College of Life Science und Bioingenieurwesen, Beijing University of Technology, Nr.100, Pingleyuan, Chaoyang District, Beijing 100124, China. Email:xmma@bjut.edu.cn; Fei Xie. College of Life Science und Bioingenieurwesen, Beijing University of Technology, Nr.100, Pingleyuan, Chaoyang District, Beijing 100124, China. Email:xiefei990815@bjut.edu.cn. Hintergrund: Untersuchung der potenziellen Auswirkungen von molekularem Wasserstoff auf Eierstockkrebs. Methoden: Die In-vivo- Studie wurde mit Hs38.T-Xenotransplantat-BALB / c-Nacktmäusen durchgeführt. Das mittlere Tumorvolumen wurde während 6 Wochen der Wasserstoffinhalation überwacht. Immunhistochemie (IHC) - Färbung wurde durchgeführt, um die Ki67 - und CD34 - Expression zu bestimmen. Die in vitro- Wirkungen von molekularem Wasserstoff auf die Proliferation von Hs38.T und PA-1 wurden durch den Cell Counting Kit (CCK) -8-Assay bestimmt. Ein Matrigel-Invasionsassay wurde durchgeführt, um die Zellinvasionsfähigkeit zu bestimmen. Verwundungsassay wurde eingesetzt, um die Beweglichkeit von Eierstockkrebszellen zu untersuchen. Ein Koloniebildungsassay wurde durchgeführt, um die Wirkung von molekularem Wasserstoff auf die Tumorigenität zu untersuchen. Um die Auswirkungen von molekularem Wasserstoff auf die Eigenschaften von Krebsstammzellen (CSCs) weiter zu untersuchen, haben wir Kugelformungstests durchgeführt. Ergebnisse: Die In-vivo- Studie zeigte, dass 6 Wochen Wasserstoffinhalation das Tumorwachstum signifikant inhibierten, was durch ein verringertes mittleres Tumorvolumen (32,30%) und die Ki67-Expression (30,00%) belegt wurde. Die Behandlung mit Wasserstoff verringerte die Expression von CD34 (74,00%), was seine Anti-Angiogenese-Effekte zeigte. Die In-vitro- Studie zeigte, dass die Wasserstoffbehandlung sowohl in Hs38.T- als auch in PA-1-Zellen die Proliferation von Krebszellen, die Invasion, die Migration und die Koloniebildung signifikant hemmt. Ein wichtiges Ergebnis dieser Studie war, dass molekularer Wasserstoff auch die Kugelbildungsfähigkeit von PA-1 und Hs38.T-Zellen deutlich hemmen kann. Schlussfolgerungen: Molekularer Wasserstoff kann eine antitumorale Rolle bei Eierstockkrebs spielen, indem er die Proliferation von CSCs-ähnlichen Zellen und Angiogenese unterdrückt. Schlüsselwörter: Eierstockkrebs; molekularer Wasserstoff; Krebsstammzellen-ähnliche Zellen (CSCs-ähnliche Zellen); Angiogenese Übermittelt am 16. Mai 2018. Für die Veröffentlichung angenommen am 11. Juli 2018. doi: 10.21037 / tcr.2018.07.09 Einleitung Anderer Abschnitt Eierstockkrebs ist die fünfte Ursache für krebsbedingte Todesfälle bei Frauen und zeichnet sich durch einen heimtückischen Beginn und das Fehlen früher spezifischer Symptome aus ( 1 ). Ovarialkarzinom kann aufgrund seines zellulären Ursprungs in drei Haupttypen eingeteilt werden, darunter Epithelzellen (90%), Sexualstrangzellen (7%) und Keimzellen (3–7%) ( 2 ). Die vorherrschende Behandlung von Eierstockkrebs besteht aus einer umfangreichen Operation, gefolgt von einer Chemotherapie. Obwohl mit der auf Taxol und Platin basierenden Chemotherapie günstige Ergebnisse erzielt werden, sind nachteilige Nebenwirkungen und erworbene Resistenz wesentliche Hindernisse bei der Behandlung von Eierstockkrebs. Trotz fortgesetzter Forschung zur Behandlung von Eierstockkrebs blieb die Heilungsrate in den letzten zwei Jahrzehnten bei etwa 30% ( 3). Daher besteht eine große Notwendigkeit, nicht-toxische Antitumor-Moleküle zur Behandlung von Eierstockkrebs zu untersuchen. Molekularer Wasserstoff gilt seit langem als physiologisch inertes Gas. Die biologische Relevanz von molekularem Wasserstoff ist seit Ohsawa et al. berichteten, dass Wasserstoffgas eine therapeutische antioxidative Wirkung ausübt und Hirnschäden durch Ischämie und Reperfusion unterdrückt ( 4 ). Andere Wissenschaftler haben auch berichtet, dass molekularer Wasserstoff bei vielen Erkrankungen therapeutische Wirkungen hat, einschließlich Verletzungen der Ischämie-Reperfusion (I / R), des metabolischen Syndroms, der Neurodegeneration, mitochondrialen Erkrankungen, Entzündungen und Krebs ( 5 ). Obwohl die Auswirkungen von molekularem Wasserstoff oft auf seine antioxidative Wirkung zurückzuführen sind, bleiben die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen schwer fassbar. Oxidativer Stress wurde mit vielen Krankheiten, einschließlich Krebs, in Verbindung gebracht. Obwohl über die potenziellen Auswirkungen von molekularem Wasserstoff auf Krebs berichtet wurde, sind diese Studien auf eine begrenzte Anzahl von Krebstypen und / oder nur auf In-vitro- Zellmodelle beschränkt. Dole et al. berichteten 1975 erstmals über die potenzielle therapeutische Rolle von molekularem Wasserstoff beim kutanen Plattenepithelkarzinom ( 6 ). Es wurde auch gefunden, dass molekularer Wasserstoff BALB / c-Mäuse vor der Entwicklung strahlungsinduzierter Thymus-Lymphome schützt ( 7 ). Frühere Studien belegen, dass molekularer Wasserstoff die Überlebensrate von Kolonkarzinom tragenden Mäusen erhöht und das Fortschreiten von Lungenkrebs hemmt ( 8 , 9). Diese Ergebnisse legen den potenziellen therapeutischen Wert von molekularem Wasserstoff für die Prävention und Behandlung von Krebs nahe. Die vorliegende Studie wurde durchgeführt, um die möglichen therapeutischen Wirkungen von molekularem Wasserstoff auf Eierstockkrebs zu untersuchen. Sowohl in vivo und in vitro wurden experimentelle Modelle verwendet , um die mögliche Rolle von molekularem Wasserstoff zu bewerten. Wir untersuchten auch die Mechanismen, die den Auswirkungen von molekularem Wasserstoff auf Eierstockkrebs zugrunde liegen. Methoden anderer Abschnitt Tiere und experimentelles Design Weibliche athymische nackte BALB / c-Mäuse wurden von der Wei Tong Li Hua Company (Peking, China) erworben. Alle Tiere wurden unter pathogenfreien Bedingungen gehalten. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den experimentellen Protokollen durchgeführt, die Tierstudien umfassten, die vom Labor für Tierethikkommission des Zentrums für funktionale Inspektion von Health Food der Hochschule für angewandte Wissenschaften der Beijing Union University genehmigt wurden. Diese Mäuse wurden unter kontrollierten Bedingungen (25 ° C, 55% Luftfeuchtigkeit und 12 h Tag / Nacht-Zyklus) gehalten und mit Standardlaborfutter gefüttert. Zur Induktion eines subkutanen Ovarialtumors 3 × 10 6Hs38.T-Zellen in 0,1 ml serumfreiem Kulturmedium wurden subkutan in die linke Flanke von Mäusen injiziert. Zwei Wochen später wurden die Mäuse mit Ovarialtumoren wie folgt zufällig in zwei Gruppen eingeteilt: (I) Mäuse in der Kontrollgruppe (Kontrolle, n = 8) wurden unter normalen Bedingungen gehalten; (II) Mäuse in der Wasserstoffbehandlungsgruppe (H, n = 8) wurden unter Verwendung einer Wasserstoff-Sauerstoff-Zerstäuber-Maschine (Shanghai Asclepius Meditec Corp., Shanghai, China) mit H 2 -Inhalation (33% H 2 /66% O 2 ) behandelt. für 30 min dreimal täglich. Das Tumorwachstum wurde durch Messung von zwei Durchmessern jedes Tumors mit einem Kaliber alle 3 Tage während einer 6-wöchigen Wasserstoffbehandlung überwacht. Das Tumorvolumen wurde unter Verwendung der Formel ( V = a × b 2) berechnet/ 2), wobei a den größten Durchmesser und b den kleinsten Durchmesser darstellt. Am Ende der 6-wöchigen Behandlung wurden die Mäuse nach ihrer letzten 30-minütigen H 2 -Behandlung eingeschläfert. Die Tumore jeder Gruppe wurden vollständig entfernt, fotografiert und in 10% igem Formalin / PBS fixiert oder für die histologische Untersuchung in flüssigem Stickstoff gelagert. Immunhistochemische Untersuchung der Expression von Ki67 und CD34 Die Paraffinschnitte wurden in Xylol entparaffiniert und mit verschiedenen Ethanolkonzentrationen rehydratisiert. Zur Deaktivierung der endogenen Oxidase wurden die Schnitte 10 Minuten mit 3% H 2 O 2 behandelt . Die Schnitte wurden mit Ziegenserum Antigen gewonnen und blockiert. Der spezifische primäre Antikörper für Ki67 oder CD34 (Abcam, Cambridge, MA, USA, 1: 300) wurde zu den Abschnitten gegeben und über Nacht bei 4 ° C und dann mit Meerrettichperoxidase-konjugierten sekundären Antikörpern für 30 Minuten bei 37 ° C inkubiert. Die Schnitte wurden dann mit 3,3'-Diaminobenzidin entwickelt und mit Hämatoxylin gegengefärbt. Die Intensität der Immunhistochemie (IHC) wurde durch zufälliges Auswählen von 3 Hochleistungsfeldern (400 ×) pro Abschnitt unter Verwendung der Image-Pro Plus-Software (Media Cybernetics, Rockville, MD, USA) gemessen. Zellkultur und Wasserstoffbehandlung Die humane Eierstockkrebszelllinie Hs38.T und PA-1 wurde freundlicherweise von Beijing Cotimes Biotech Corp. und der Cell Bank of Peking Union Medical College (PUMC, Peking, China) zur Verfügung gestellt, die in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) oder Minimum Essential Medium kultiviert wurden mit ausgewogenen Salzen von Earle (MEM / EBSS), die 10% fötales Rinderserum (FBS) enthalten, in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 bei 37 ° C. Sowohl Hs38.T- als auch PA-1-Zellen wurden in zwei Gruppen unterteilt: (I) Zellen in Kontrollgruppe (Kontrolle) wurden in normalem vollständigen Medium kultiviert; (II) Zellen in der Wasserstoffbehandlungsgruppe (HM) wurden in wasserstoffreichem Medium kultiviert. Das wasserstoffreiche Medium wurde hergestellt, indem ein steriles Kunststoffschalenprodukt, bestehend aus metallischem Magnesium (Reinheit 99,9%) und Natursteinen, in die mit Keramik kombinierten Polypropylenbehälter (Doctor SUISOSUI) gegeben wurde® ; Friendear Inc., Tokio, Japan) in DMEM-Medium, das 10% FBS enthält, für mehr als 48 Stunden vor der Verwendung bei Raumtemperatur. Die Wasserstoffkonzentration wurde unter Verwendung eines Nadel-Wasserstoffsensors (Unisense A / S, Aarhus, Dänemark) jede Woche überwacht. Der Stift wurde alle zwei Wochen ausgetauscht, um sicherzustellen, dass eine H 2 -Konzentration von mehr als 600 μM aufrechterhalten wurde. Zelllebensfähigkeitsanalyse Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde unter Verwendung eines Cell Counting Kit (CCK) -8-Assays (Dojindo Molecular Technologies Inc., Gaithersburg, MD, USA) bestimmt. Die Zellen wurden in 96-Well-Platten mit einer Konzentration von 5,0 × 10 3 / Well plattiert und 24 Stunden kultiviert. Zur Entwicklung von Wachstumskurven wurden die Zellen 0, 24, 48, 72, 96 und 120 Stunden in normalem vollständigem Medium oder wasserstoffreichem Medium weiter kultiviert. Nach der Inkubation wurden 10 & mgr; l CCK-8-Lösung zu jeder Vertiefung gegeben und 3 Stunden bei 37 ° C inkubiert. Der Extinktionswert jeder Vertiefung wurde sofort bei 450 nm unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts (Bio-Rad, Richmond, CA, USA) abgelesen. Zellinvasionstest Die Zellinvasionsfähigkeit wurde unter Verwendung von BD-Matrigel-Invasionskammern gemäß dem Protokoll des Herstellers bestimmt. Kurz gesagt, die oberen Kammern mit Polycarbonatfiltern (8 um Porengröße; Costar, Acton, MA, USA) wurden mit 50 ul Matrigel (0,8 ug / ul, 37ºC, 2 h; BD Biosciences, San Diego, CA) . 1 × 10 5Zellen in 100 ul serumfreiem Medium wurden in die obere Kammer ausgesät und 650 ul Normalmedium oder wasserstoffreiches Medium wurden am Boden zugegeben. Man ließ die Zellen 48 Stunden bei 37 ° C durch die poröse Membran wandern. Zellen in der oberen Oberfläche der Kammer wurden vollständig mit Wattestäbchen entfernt. Die Zellen auf der unteren Oberfläche wurden nach der Fixierung mit 0,1% (Gew./Vol.) Kristallviolett angefärbt und fünf zufällige Felder aus jedem Einsatz wurden bei 100-facher Vergrößerung gezählt. Der Invasionsassay wurde in drei unabhängigen Versuchen durchgeführt. Zellmigrationstest Der Zellmigrationsassay wurde unter Verwendung eines Wundheilungsassays durchgeführt. Kurz gesagt, Zellen wurden in 6-Well-Platten mit einer Konzentration von 1,0 × 10 6 / Well ausgesät und 24 Stunden lang kultiviert. Eine Kunststoffpipettenspitze wurde verwendet, um eine Linie über die Zelloberfläche in jeder Platte zu kratzen. Die verbleibenden Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen, um die schwebenden Zellen und Trümmer zu entfernen, gefolgt von einer Inkubation für 48 Stunden in normalem Vollmedium oder Wasserstoff-reichem Medium. Die Bilder des Heilungsprozesses wurden zum Zeitpunkt 0, 24 Stunden nach der Verwundung digital fotografiert. Der Wundheilungsassay wurde in drei unabhängigen Experimenten durchgeführt. Koloniebildungsassay Eintausend Zellen pro Well wurden gezählt und in 6-Well-Platten ausgesät. Die Platten wurden 14 Tage in normalem oder wasserstoffreichem Medium inkubiert. Die Zellen wurden dann mit 4% Paraformaldehyd fixiert und mit 0,1% Kristallviolett angefärbt. Kolonien wurden nur gezählt, wenn sie mindestens 15 Zellen enthielten. Dreifache unabhängige Experimente wurden durchgeführt und alle sichtbaren Kolonien wurden manuell berechnet. Kugelbildungsassay Die Zellen wurden gesammelt und zur Entfernung des Serums gewaschen, dann in serumfreiem DMEM- oder MEM / EBSS-Medium mit einer Dichte von 2,0 × 10 3 / ml suspendiert . Fünfhundert Zellen pro Vertiefung wurden gezählt und auf 6-Well-Platten mit extrem niedriger Anhaftung (Corning, Corning, NY, USA) für den Kugelbildungsassay ausgesät. Zellen wurden in normalem serumfreiem Medium oder wasserstoffreichem serumfreiem Medium mit B27-Supplement (GIBCO, Grand Island, New York, USA), 20 ng / ml epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) (Pepro Tech Inc., Rocky Hill) kultiviert , New Jersey, USA) und 20 ng / ml basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) (Pepro Tech). Das Medium wurde alle 3 Tage gewechselt. Die Zellen wurden 10 Tage inkubiert und Kugeln mit einem Durchmesser von> 50 um wurden gezählt. statistische Analyse Gruppen aus der Zellkultur und in vivo unter Verwendung von zweiseitigen Student-Experimente wurden im Vergleich t -Tests und präsentierten Ergebnisse wurden als Mittelwert ± SD. Alle statistischen Analysen wurden mit GraphPad Prism 6.01 durchgeführt. Ein Wert von P <0,05 wurde als signifikant angesehen. Ergebnisse anderer Abschnitt Molekularer Wasserstoff unterdrückt das Tumorwachstum in vivo Um den Einfluss von molekularem Wasserstoff auf die Biologie des Ovarialkarzinoms in vivo anzugehen, wurden Hs38.T-Zellen auf Nacktmäuse Xenotransplantiert und 6 Wochen lang mit Wasserstoff behandelt. Wie in 1A gezeigt , erreichte der Unterschied im mittleren Tumorvolumen in Woche 5 statistische Signifikanz, eine deutliche Verringerung nach Wasserstoffbehandlung wurde in Woche 5 (33,06%, P = 0,0475) und Woche 6 (32,30%, P = 0,0347) verglichen mit den Kontrollen. Abbildung 1 Wasserstoffinhalation inhibierte das Tumorwachstum und die Angiogenese in Hs38.T-Xenotransplantat-BALB / c-Nacktmäusen. (A) Sechs Wochen Wasserstoffinhalation induzierten eine signifikante Abnahme des mittleren Tumorvolumens. (B) eine immunhistochemische Untersuchung zeigte, dass die Expression von Ki67 und CD34 durch molekularen Wasserstoff herunterreguliert wurde; (C) Quantifizierung der immunhistochemischen Färbung. *, P <0,05; **, P <0,01. HI, Wasserstoffinhalation. Auswirkungen von molekularem Wasserstoff auf die Expression von Ki67 und CD34 Die IHC-Analyse mit Ki67-Färbung zeigte, dass der Prozentsatz von Ki67-positiven proliferierenden Zellen in der Wasserstoffgruppe um 30,00% niedriger war als in den Kontrollen ( 1B, C ). Die Angiogenese wurde durch CD34-Immunhistochemie bewertet, und die Ergebnisse zeigten, dass der Anteil an CD34-positiven Zellen in der Wasserstoffgruppe im Vergleich zu den Kontrollen signifikant um 74,00% gesunken war ( 1B, C ). Auswirkungen von molekularem Wasserstoff auf Zellwachstum, Invasion und Migration In-vitro- Wirkungen von molekularem Wasserstoff auf die Proliferation menschlicher Eierstockkrebszellen wurden durch den CCK-8-Assay bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Wasserstoffbehandlung in PA-1-Zellen eine etwas langsamere Wachstumsrate induzierte und die maximale Wirkung auf die Proliferationshemmung zum Zeitpunkt von 24 Stunden beobachtet wurde (12,97%) ( 2A ). In ähnlicher Weise gab es nach der Wasserstoffbehandlung eine verringerte Wachstumsrate in Hs38.T-Zellen. Molekularer Wasserstoff inhibierte die Zellproliferation zum Zeitpunkt 48 und 96 h signifikant um 22,79% bzw. 17,26% ( 2B ). Abbildung 2 Die Auswirkungen von molekularem Wasserstoff auf die Zellfunktion menschlicher Eierstockkrebszellen. (A, B) CCK-8-Assay zeigte, dass die Zellproliferation durch Wasserstoffbehandlung in PA-1 und Hs38.T-Zellen inhibiert wurde; (C, D) Matrigel-Invasionsassay zeigte, dass die Wasserstoffbehandlung die Zellinvasion sowohl in PA-1- als auch in Hs38.T-Zellen signifikant hemmt; (E, F) Wundheilungsassay zeigte an, dass die Zellwanderung von PA-1 und Hs38.T-Zellen durch Wasserstoff inhibiert wurde. *, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0,001; ****, P <0,0001. CCK-8, Cell Counting Kit-8, HM, wasserstoffreiches Medium. Parallel dazu wurde ein Matrigel-Invasionsassay durchgeführt, um die Wirkung der Wasserstoffbehandlung auf die Invasion menschlicher Eierstockkrebszellen zu bestimmen. Wie in 2C, D gezeigt , induzierte die Wasserstoffbehandlung sowohl in Hs38.T- als auch in PA-1-Zellen eine signifikante Verringerung der Invasivität der Zellen (39,28%, P = 0,0284 und 72,36%, P = 0,0005). In-vitro- Wundversuche wurden eingesetzt, um den Einfluss der Wasserstoffbehandlung auf die Wanderung von menschlichen Eierstockkrebszellen zu untersuchen. Wie in Fig. 2E, F gezeigt , hemmte die Anwesenheit von Wasserstoff die bewegliche Natur sowohl in PA-1- als auch in Hs38.T-Zellen signifikant um 20,32% (P = 0,0136) und 38,96% (P = 0,0307). Auswirkungen von molekularem Wasserstoff auf die Klonogenität in vitro Um die potenzielle Rolle von molekularem Wasserstoff bei der Tumorigenität zu untersuchen, wurde ein In-vitro- Koloniebildungsassay durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Wasserstoffbehandlung sowohl in Hs38.T- als auch in PA-1-Zellen deutlich weniger und kleinere Kolonien induzierte. Wie in 3 gezeigt , verringerte die Wasserstoffbehandlung die Kolonienzahlen von PA-1 (45,11%, P = 0,0015) und Hs38.T-Zellen (19,70%, P = 0,0021) signifikant. Sowohl bei PA-1 (31,08%, P = 0,0002) als auch bei Hs38.T-Zellen (38,33%, P <0,0001) war der Durchmesser der Kolonien nach der Wasserstoffbehandlung deutlich verringert. Abbildung 3 Die hemmende Wirkung von molekularem Wasserstoff auf die Klonogenität in menschlichen Eierstockkrebszellen. (A) Repräsentative Bilder zeigten die Hemmwirkung von molekularem Wasserstoff auf die Koloniebildung; (B) die Anzahl der Kolonien wurde durch Wasserstoffbehandlung sowohl in PA-1- als auch in Hs38.T-Zellen signifikant verringert; (C) der durchschnittliche Durchmesser der Kolonien sowohl in PA-1 als auch in Hs38.T-Zellen war in der Wasserstoffgruppe deutlich geringer als der der Kontrollen. **, P <0,01; ***, P <0,001; ****, P <0,0001. HM, wasserstoffreiches Medium. Auswirkungen von molekularem Wasserstoff auf die Kugelbildung Um die Auswirkungen von molekularem Wasserstoff auf die Eigenschaften von Krebsstammzellen (CSC) weiter zu untersuchen, haben wir Kugelbildungsassays durchgeführt. Wie in Abbildung 4 zu sehen ist , verringerte Wasserstoff zwar den statischen Wert der Floating-Sphere-Anzahl von Hs38.T-Zellen durch statischen Signifikanz nicht signifikant, der durchschnittliche Durchmesser der Floating-Sphäre nahm jedoch um 41,48% (P <0,0001) ab. In den PA-1-Zellen führte die Wasserstoffbehandlung zusätzlich zu einer deutlichen Reduktion der Kugelzahl (82,47%, P = 0,0006) und des durchschnittlichen Durchmessers (55,25%, P <0,0001). Abbildung 4 Die hemmende Wirkung von molekularem Wasserstoff auf die Kugelbildung in humanen Eierstockkrebszellen. (A) Repräsentative Bilder zeigten die Hemmwirkung von molekularem Wasserstoff auf die Kugelbildung; (B) die Zahl der schwebenden Kugeln von PA-1-Zellen wurde durch Wasserstoffbehandlung signifikant verringert, während bei Hs38.T-Zellen keine merkliche Veränderung beobachtet wurde; (C) Der durchschnittliche Durchmesser der schwebenden Kugel in Hs38.T- und PA-1-Zellen war in der Wasserstoffgruppe deutlich geringer als bei Kontrollen. ***, P <0,001; ****, P <0,0001. HM, wasserstoffreiches Medium. Diskussion Anderer Abschnitt Obwohl die therapeutischen Wirkungen von molekularem Wasserstoff in einem breiten Spektrum von Krankheitsmodellen und menschlichen Krankheiten untersucht wurden, gibt es nur eine mangelhafte Anzahl von Berichten über die Antitumorwirkung von molekularem Wasserstoff. Nach unserem besten Wissen ist dies der erste Bericht, der In-vivo- und In-vitro- Beweise liefert , die die potenzielle therapeutische Rolle von molekularem Wasserstoff bei Eierstockkrebs aufzeigen. Unsere In-vivo- Studie hat gezeigt, dass die Wasserstoffinhalation für 6 Wochen das Tumorwachstum in einem Mausmodell für Eierstockkrebs signifikant unterdrückt. Diese Antitumorwirkung von molekularem Wasserstoff wurde auch auf zellulärer Ebene bestätigt. Die in vitroDie Studie zeigte, dass die Wasserstoffbehandlung die Zellproliferation, Invasion, Migration, Koloniebildung und Kugelbildung in Hs38.T- und PA-1-Zellen signifikant inhibierte. Diese Ergebnisse legen das klinische Potenzial molekularen Wasserstoffs für präventive und therapeutische Antitumoranwendungen nahe. Seit 2007, als Ohsawa et al. berichteten, dass die Inhalation von 2% Wasserstoffgas das Gehirn vor Verletzungen der I / R und Schlaganfall schützen kann ( 4 ) normobarer Wasserstoff. Hyperbarer Wasserstoff oder eine hohe Wasserstoffkonzentration kann bei einigen Krankheiten wirksam sein, es wurde jedoch nur eine begrenzte Anzahl von Studien veröffentlicht. Dole et al. kündigte erstmals 1975 in Science eine krebswidrige Wirkung von Wasserstoff an ( 6). Sie fanden heraus, dass die Inhalation von 2,5% Sauerstoff und 97,5% Wasserstoff unter 8 Atmosphärendruck eine ausgeprägte Unterdrückung des Plattenepithelkarzinoms zeigt. Eine kürzlich durchgeführte Studie hat gezeigt, dass die Inhalation von 60% Wasserstoffgas für 4 Wochen in einem Xenotransplantatmodell in Nacktmäusen die Karzinogenese bei Lungenkrebs hemmen kann. Diese In-vitro- Studie hat gezeigt, dass eine höhere Wasserstoffkonzentration eine bessere Antitumorwirkung haben kann ( 9 ). Unsere Studie zeigte, dass die Inhalation von 66,7% Wasserstoffgas eine Rolle des Tumors bei Eierstockkrebs spielen kann. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine hohe Wasserstoffkonzentration bei der Behandlung von Krebs wirksamer sein kann, obwohl die Dosis-Wirkungs-Beziehung von Wasserstoff weiter untersucht werden muss. Es gibt drei Methoden, die am häufigsten zur Verabreichung von Wasserstoff verwendet werden, einschließlich Inhalation von Wasserstoffgas, Trinken von wasserstoffreichem Wasser und Injektion von wasserstoffreicher Salzlösung. Das Einatmen von Wasserstoffgas erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass H 2 -Moleküle in hohen Konzentrationen an das Krebsgewebe gelangen, was beim Trinken oder bei der Injektion nicht der Fall sein kann. Die In-vivo- Studie hat 30 Minuten lang Wasserstoff eingeatmet, was ausreichen könnte, um ein Gleichgewicht zu erreichen. Bei 66,7% H 2 würde die Wasserstoffkonzentration theoretisch bei etwa 520 & mgr; M liegen, was mit der In-vitro- Studie von 600 & mgr; M H 2 vergleichbar ist. Zusätzlich inhalierten Mäuse eine höhere Sauerstoffkonzentration (33,3%); Folglich kann die Anwesenheit von erhöhtem Sauerstoff auch das Krebswachstum hemmen ( 10 ). In der aktuellen Studie hemmten 6 Wochen Wasserstoffinhalation das Wachstum von Eierstockkrebs signifikant. Dies wurde weiter durch die IHC-Untersuchung bestätigt, die zeigte, dass molekularer Wasserstoff die Expression des Proliferationsmarkers Ki67 herunterreguliert. Die In-vitro- Studie bestätigte auch die Hemmwirkung von molekularem Wasserstoff auf Eierstockkrebs, was durch die verringerte Zellproliferation in Hs38.T- und PA-1-Zellen belegt wird. Frühere Studien haben auch den hemmenden Effekt von molekularem Wasserstoff auf Krebs nachgewiesen. Saitoh et al. berichteten, dass molekularer Wasserstoff die Wachstumshemmung der menschlichen Zungenkarzinomzellen HSC-4 und der menschlichen Fibrosarkomzellen HT-1080 verursachte, das Wachstum normaler menschlicher Zungenepithelzellen (DOK) jedoch nicht beeinträchtigte ( 11)). In einem anderen Bericht haben Kawai et al. etablierte ein mit Streptozotocin induziertes, nichtalkoholisches Steatohepatitis (NASH) -abhängiges hepatokarzinogenes Mausmodell und stellte fest, dass das Trinken von wasserstoffreichem Wasser für 8 Wochen die NASH-bedingte Hepatokarzinogenese verbessern kann, was durch die Verringerung der Tumorzahl und der Tumorgröße belegt wird; Diese Studie lieferte jedoch keinen Beweis für die Hemmwirkung auf das Tumorwachstum ( 12 ). Neuere Studien legen nahe, dass bösartige Tumore als abnorme Organe mit einer kleinen Untermenge von CSCs angesehen werden können, die sich selbst erneuern, differenzieren und einen neuen Tumor erzeugen können ( 13 ). Diese CSCs sind für die Aufrechterhaltung des Tumorwachstums, der Metastasierung und der Arzneimittelresistenz verantwortlich ( 14 ). CSCs verhalten sich wie Stammzellen, indem sie sich selbst erneuern und in heterogene Tumorzellen differenzieren können. Die PA-1-Zelllinie ist ein hervorragendes Modell für CSCs, da sie den putativen CSCs-Marker CD133 ( 15 , 16 ) reichlich exprimiert . Neben der Verwendung von Biomarkern zur Unterscheidung von CSCs ist die Analyse der Fähigkeit zur Kugelbildung auch eine zuverlässige Methode zum Nachweis und zur Charakterisierung von CSC-Populationen ( 16)). Ein wichtiges Ergebnis dieser Studie war, dass molekularer Wasserstoff die Kugelbildungsfähigkeit von PA-1 und Hs38.T-Zellen deutlich hemmen kann. Diese Daten legen nahe, dass die CSCs-ähnlichen Zellen bei Eierstockkrebs möglicherweise anfälliger für eine Wasserstoffbehandlung sind, und die Abnahme an CSCs-ähnlichen Zellen kann zu einer verringerten Zellproliferation bei den gesamten Eierstockkrebszellen führen. Die Angiogenese ist ein pathophysiologischer Prozess, bei dem neue Blutgefäße aus bereits bestehenden Kapillaren, übermäßigen und anomalen Gefäßen, wachsen, was zum Fortschreiten solider Tumoren beiträgt ( 17 ). Eine wichtige Erkenntnis in dieser Studie war, dass molekularer Wasserstoff die Angiogenese bei Eierstockkrebs unterdrücken kann, was durch eine verminderte Expression von CD34 in mit Wasserstoff behandelten Mäusen belegt wird. Dieser Anti-Angiogenese-Effekt wurde auch in einem früheren Bericht beobachtet. Ye et al. zeigten, dass molekularer Wasserstoff die durch A549-Zellen induzierte Angiogenese durch Herunterregulierung sowohl der H 2 O 2 -Freisetzung als auch der VEGF-Expression unterdrücken kann ( 18 ). Einige Ergebnisse der Studie von Ye et al.kann auch auf PtNPs aus der Elektrolyse zurückzuführen sein. Diese Ergebnisse legen nahe, dass molekularer Wasserstoff durch die Hemmung der Angiogenese seine Antitumorfunktion ausüben kann. Die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen bedürfen jedoch einer weiteren Aufklärung. Wir haben auch die Wirkung von molekularem Wasserstoff auf die Migration und Invasion von Eierstockkrebszellen untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass molekularer Wasserstoff die Zellmigration sowohl in PA-1- als auch in Hs38.T-Zellen unterdrücken kann. In einer früheren Studie ( 11 ) wurde über die repressive Wirkung von molekularem Wasserstoff auf die Zellinvasion von HT-1080-Zellen berichtet ( 11 ), und diese Wirkung wurde sowohl in Hs38.T- als auch in PA-1-Zellen beobachtet. Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass molekularer Wasserstoff durch die Regulation der Zellinvasion und -migration seine Antitumorwirkung bei Eierstockkrebs ausüben kann. Zusammenfassend zeigt die vorliegende Studie, dass die Inhalation von 66,7% molekularem Wasserstoff einen hemmenden Effekt auf das Wachstum von Eierstockkrebs hat. Darüber hinaus unterdrückt molekularer Wasserstoff auch die Proliferation von CSCs-ähnlichen Zellen und die Angiogenese, was zu dessen Antitumorwirkung beitragen kann. Daher legen unsere Ergebnisse nahe, dass molekularer Wasserstoff möglicherweise zur Behandlung von Eierstockkrebs verwendet wird. Danksagung Anderer Abschnitt Finanzierung : Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (Fördernummer: 31500828) unterstützt. Fußnote anderer Abschnitt Interessenkonflikte : Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären. Ethische Aussage : Die Verwendung von Tieren wurde von der Ethikkommission der Institutionen genehmigt, nachdem der Leitfaden des National Research Council zur Pflege und Verwendung von Labortieren verabschiedet wurde. Die ethische Zulassungsnummer lautet 2016S012. Referenzen anderer Abschnitt Karnezis AN, Cho KR, Gilks CB, et al. Die unterschiedlichen Ursachen von Ovarialkarzinomen: Pathogenese und Präventionsstrategien. Nat Rev Cancer 2017; 17: 65-74. [ Crossref ] [ PubMed ] Shanmugasundaram G., Sundaramoorthy E., Sudalaiandi S., et al. 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